本方法适用于总长度（载体+所有片段）不超过20kb的重组实验。对于目的片段的引物设计与PCR扩增，建议使用高保真酶进行PCR扩增，并探索最佳退火温度，优化反应体系和程序。

载体线性化

双酶切：选择两种限制性内切酶对载体质粒进行线性化处理。内切酶的选择可以参考第二章第一节内容。对于目的片段和线性化载体的纯化回收，推荐使用切胶回收方式进行提取（切胶时间最好控制在3分钟内，以避免紫外线对DNA的损害）。使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收浓度，应至少为20ng/μl，并通过跑胶鉴定是否为单一目的条带。

在回收浓度较低的情况下，可以通过增加PCR/酶切反应体系的体积，并采用多管反应单管回收的方法，以提高回收产物的浓度。

目的片段与线性化载体的连接重组

连接反应体系应根据说明书要求计算投入量，体系中各组分的投入体积应不少于1μl；如果浓度过高，可以适当稀释。

感受态细胞转化

对于连接产物转化，建议选择DH5α或Fast-T1等克隆用化学感受态细胞。需注意，感受态细胞不可反复冻融，-80°C取出后应一次性使用。重组产物体积与感受态细胞体积的比例应为1:10。例如，可以将10μl重组产物加入至100μl感受态细胞，或者5μl重组产物加入至50μl感受态细胞。

热激时间应按照感受态细胞的说明书操作。平板抗生素的抗性需与转化载体的抗性一致。在涂板时，应将菌液进行离心（2500×g，3min），用移液枪吸取丢弃多余的LB培养基，保留100μl悬浮液后全部涂板；或者吸取适当体积进行涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

挑取平板中体积适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落。建议挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析。将挑取的菌落放入已添加10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中溶解混匀后，吸取1-2μl作为PCR反应（10/20μl体系）的模板。推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行PCR鉴定。

常见问题分析

1. 如果克隆长度不足，可能是引物同源臂设计错误：长度应在15-20bp之间，GC含量保持在40-60%最为适宜。建议使用927855cc永利官网在线设计工具进行设计。

2. 重组反应体系的不符合要求：片段和线性化载体的总长度应不超过20kb，应切胶回收且浓度不低于20ng/μl；浓度过高时需稀释，确保体系投入体积不少于1μl。

3. 连接反应不适当：反应应在PCR仪中进行，按照说明书设置温度和时间。如果同源臂GC含量超过60%或连接片段数较多，可以适当延长至30分钟。

4. 进行阳性对照反应时，请使用试剂盒中提供的线性化载体和插入片段，并按说明书配制重组反应体系，以排除其他实验材料及操作因素的影响。

5. 注意转化涂板操作的正确性：建议使用DH5α、Fast-T1等克隆用化学感受态细胞。重组产物体积与感受态体积比例为1:10，热激时间按感受态细胞说明书操作，平板抗性需保持一致，涂板前将菌液离心处理。

这些注意事项有助于提高重组实验的成功率，从而推动生物医疗领域的研究进展。