### 产品及特点

本产品是基于探针法荧光定量PCR原理研发的检测试剂盒，具有以下显著特点：

1. 即开即用：用户只需提供样品DNA模板。

2. 高灵敏度：引物等组分经过优化，确保敏感度显著提升。

3. 阳性对照：提供阳性对照，方便识别假阴性样品。

4. 高特异性：引物设计基于中间普雷沃菌DNA序列的高度保守区，避免与其他生物样本DNA发生交叉反应。

5. 多功能性：本产品不仅可用于定性检测，还可实施定量检测，线性范围至少达到五个数量级。

6. 充足的试剂量：本产品足以支持50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

7. 限制用途：此产品仅限于科研使用。

### 方法

**一、DNA提取（样本制备区）**

使用自选方法提取并纯化样品DNA，本试剂盒与市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

**二、稀释标准曲线样品（样本制备区）**

为了避免污染样品或本试剂盒的其他成分，阳性对照的浓度较高，以下稀释操作应在独立区域内进行：

1. 标记六个离心管，编号为7、6、5、4、3、2。

2. 使用带芯枪头，向各管中加入45μL DEPC-H2O。

3. 在7号管中添加5μL的阳性对照（浓度为1×10E8拷贝/μL），充分震荡1分钟，得到1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品，置于冰上待用。

4. 换枪头，在6号管加入5μL的标准曲线样品，充分震荡1分钟，得到1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品，置于冰上待用。

5. 重复以上操作，直至获得六个不同稀释度的标准曲线样品，置于冰上待用。若不制作标准曲线，只需将阳性对照稀释至1×10E5拷贝/μL即可。

**三、试剂配制（试剂准备区）**

根据待检样品数量准备N+2个qPCR管，向各PCR管中分别加入所需成分（具体见详细说明书，欢迎咨询88858cc永利官网）。

**四、添加模板（模板添加区）**

向qPCR管中分别加入2μL模板，并按顺序添加阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板和阳性对照，随后离心30秒，立即进行扩增反应。

**五、扩增反应（扩增及产物分析区）**

将PCR管放入PCR扩增仪器的样品槽，并按照扩增程序进行（具体见详细说明书，欢迎咨询88858cc永利官网）。

**六、结果分析**

1. 如制作标准曲线，则以阳性对照浓度的log值为横轴，Ct值为纵轴绘制标准曲线。利用待测样品的Ct值推算样品DNA浓度的log值。

2. 如未制作标准曲线，按照以下标准判定结果：

- 阳性对照：Ct值<30，呈现明显的指数增长，曲线按典型S型显示。

- 阴性对照：Ct值38或无Ct值，无明显的指数增长和平台期。

- 样本检测结果：Ct值<35，表明样本中检测到婴儿利什曼虫，结果为阳性；Ct值38或无Ct值，表明未检测到，结果为阴性；若Ct值在35-38范围，应复检，如重复实验仍在此范围且有明显增长，则判定为阳性，否则为阴性。

### 运输及保存

产品需低温运输，保存于-20℃，有效期为一年。阳性对照需单独存放，避免污染其他试剂。